本发明涉及细胞应用领域，具体来说，涉及利用动物高活性肌肉和脂肪前体细胞产生细胞培养肉的方法。
1、人造肉，即细胞培养肉（cell-based meat/cbm），近几年来得到全球舆论和市场的广泛关注。联合国粮食及农业组织（fao）预测，到2050年，全球肉类需求将达到4.55亿吨（比2005年增长76％）。由于当前的大型畜牧业的生产方法与公共卫生问题的复杂性，以及肉类生产相关的温室效应、环境退化和动物福利等问题，全球不断增长的肉类需求引起了越来越多的担忧和负面后果。畜牧业的大规模发展与食源性疾病、抗生素抗性和传染性疾病的规模化流行相互关联，密切影响了人类的身体健康。畜牧业也加剧了环境问题，包括温室气体排放，以及土地和水资源利用。还有动物福利和伦理问题，每年有数十亿动物被人类食品系统的运转所直接或间接消灭。
2、而这些肉类生产所伴随着的各种负面问题，和干细胞技术这些年的迅速发展，催生了人们对人造肉这一类新型产品的热烈讨论和研究。基于植物的肉类（pbm）和基于细胞的肉类（cbm）方法可从非动物来源生产食物。近几年人们开始了cbm细胞农业的新领域的发展，即从细胞而不是整个生物或动物生产人造肉商品的策略。cbm的生产一旦优化，预计将需要更少的能量和资源并减少浪费。cbm可以取代一些集约化畜牧业来改善农场动物的福利。动物供体只是用于提供细胞的初始来源，随后可在体外扩增细胞。cbm的生产一般涉及四个主要组成部分：（1）肌肉等细胞的分离和培养；（2）高效培养基的配方；（3）细胞培养支架的选择；（4）细胞培养装置的设计。新技术的发展已经催生了一些致力于将cbm产品推向市场的全球公司。cbm现在已经从科幻小说中的想象变成了现实有形的实物。而这项技术在国内尚处于发展初期。
3、因此，本发明提出了一种利用动物高活性肌肉和脂肪前体细胞产生细胞培养肉的方法。
1、针对相关技术中的问题，本发明提出利用动物高活性肌肉和脂肪前体细胞产生细胞培养肉的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
3、利用动物高活性肌肉和脂肪前体细胞产生细胞培养肉的方法，该方法包括以下步骤：
7、s4、利用植物细胞外基质作为细胞生长支架进行培养获取动物细胞肉培养层；
9、进一步的，所述筛选获得高活性的田鼠肌肉前体细胞，并进行初步扩增包括以下步骤：
11、s12、利用肌肉前体细胞贴壁（胶原蛋白表面）生长较慢的特性（36~48小时之后贴壁的细胞），去除快速贴壁生长和不贴壁生长的肌肉内其它细胞；
12、s13、筛选出具有高效肌肉分化能力的前体细胞（包括肌肉干细胞和肌肉母细胞等），并进行常规2d表面的培养来初步扩增。
13、进一步的，所述利用肌肉前体细胞贴壁生长较慢的特性，去除快速贴壁生长和不贴壁生长的肌肉内其它细胞包括以下步骤：
14、将来自田鼠肌肉组织的原代的肌肉前体细胞，根据其对胶原蛋白表面的贴壁特性进行分离筛选，分离出约总细胞数约20%的贴壁慢的细胞，包含95%以上的肌肉前体细胞。
15、进一步的，所述筛选获得高活性的田鼠脂肪前体细胞，并进行初步扩增包括以下步骤：
17、s22、利用脂肪前体细胞贴壁（胶原蛋白表面）生长较快的特性（6~12时之内贴壁的细胞），去除慢速贴壁生长和不贴壁生长的脂肪内其它细胞；
18、s23、筛选出具有高效脂肪细胞分化能力的前体细胞，并进行常规2d表面的培养来初步扩增。
19、进一步的，所述利用脂肪前体细胞贴壁生长较快的特性，去除慢速贴壁生长和不贴壁生长的脂肪内其它细胞包括以下步骤：
20、将来自田鼠脂肪组织的原代的脂肪前体细胞，根据其对胶原蛋白表面的贴壁特性进行分离筛选，分离出约总细胞数约50%的贴壁快的细胞，包含95%以上的脂肪前体细胞。
21、进一步的，所述利用浸泡去除法获取脱细胞的植物细胞外基质薄层包括以下步骤：
22、s31、将预先备置的葡萄叶或菠菜叶处理为预设面积（1cm2~4cm2）的小块，并利用5%~15%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，sds）浸泡2~4天去除细胞；
23、s32、再利用0.1%~0.3%的tritonx-100（曲拉通）浸泡1~3天，得到去细胞的细胞外基质，并进行水洗和高压灭菌，得到植物细胞外基质薄层备用。
24、进一步的，所述利用植物细胞外基质进行培养获取细胞外基质的细胞肉培养层包括以下步骤：
25、s41、将处于对数生长期的肌肉前体细胞和脂肪前体细胞以预设比例混合导入植物细胞外基质薄层结构；
26、s42、利用该3d细胞外基质作为细胞生长支架进行大规模的细胞培养扩增；
27、s43、向培养液中加入刺激肌肉前体细胞生长的jagged1 多肽，诱导肌肉前体细胞保持细胞特性和加快生长，并如此培养5~8天。
28、进一步的，所述将处于对数生长期的肌肉前体细胞和脂肪前体细胞以预设比例混合导入植物细胞外基质薄层结构包括以下步骤：
29、将处于对数生长期中第4到6代的肌肉前体细胞和脂肪前体细胞以3:1~9:1的比例混合导入植物细胞外基质薄层结构，其中，所述植物细胞外基质薄层结构的厚度为2~5mm。
30、进一步的，所述获得分化为成熟肌肉纤维细胞的立体结构组织，即细胞培养肉包括以下步骤：
31、s51、利用细胞铲将细胞肉培养层单层从培养液中取出，并铺于新的培养盘中，层层叠加将细胞单层摞在一起；
32、s52、加入含有jagged1多肽的细胞培养液继续静置培养 2~4天；
33、s53、将培养细胞的立体多层结构加入肌肉细胞成肌分化培养液继续培养5~7天；
34、s54、培养结束后收取产生的肌肉细胞组织进行形态和肌肉细胞分化程度的检测鉴定。
35、进一步的，所述利用细胞铲将细胞肉培养层单层从培养液中取出，并铺于新的培养盘中，层层叠加将细胞单层摞在一起包括以下步骤：
36、利用细胞铲将细胞肉培养层单层从培养液中取出，并铺于新的培养盘中，层层叠加将4~6层的细胞单层摞在一起；
37、所述将培养细胞的立体多层结构加入肌肉细胞成肌分化培养液继续培养5~7天包括以下步骤：
38、将培养细胞的立体多层结构加入肌肉细胞成肌分化培养液继续培养5~7天，期间继续加入follistatin（follistatin 344，100~200ng/ml，其中优选的终浓度是150ng/ml）促进肌肉细胞的成长增大和分化，其中，基础培养液是dmem细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为1~3%（其中优选的，终浓度为2%）、鸡胚胎精华提取物最终体积分数为0.5%~2%（其中优选的，终体积比时1%）。
39、本发明的有益效果为：本发明的高活性肌肉前体细胞作为一种来自年轻动物个体的原代细胞，在基本保持了强大的细胞成肌分化能力的前体下，比常规的肌肉干细胞的分离纯化程序具有更高的效率和更低的成本，并可分离更多的细胞量。且该高活性脂肪前体细胞的分离方法也具有同样的高效率的优势，并且脂肪细胞的加入和与肌肉细胞的共培养可以增强细胞肉的营养和口感等。同时，本发明采用的植物来源的细胞外基质作为动物细胞的成长和分化的载体，可有效承载肌肉和脂肪细胞的培养，具有低成本，来源广泛和制备方便等优势。细胞外基质结合了jagged1的多肽片段，可以有效激活前体细胞的notch信号通道，从而更好的保持前体细胞的特性（生长分化潜力）。培养液中添加的follistatin是可以抑制myostatin的活性，从而让肌肉龙8细胞的体积、生长和分化都更有潜力，而分化成的肌肉纤维更粗壮。
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