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1、第一章细胞培养的基本理论知识，细胞培养技术，第一节细胞培养的基本概念，第一，细胞培养技术细胞培养技术从人或活动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在体外存活，生长，维持结构和功能的技术一般称为体外培养。细胞培养、体外培养、组织培养、器官培养、细胞培养是单个细胞和细胞群体。组织培养是指从体内移除组织，生存，成长，维持其结构和功能的方法。器官培养(OrganCulture)是维持器官的元气、部分或全部器官在体外生存、生长和某些功能的方法。胚胎和成体、活检或手术可以去除组织或器官的三种培养方法的来源很广。组织或器官去除筋膜，脂肪组织后粗切削，器官培养，组织培养(1mm3)，细胞培养(单细胞)，
2、显微切割，酶消化，第二，细胞培养的优点和缺点：1。长时间，直接观察，研究活细胞的形态，结构，生命活动等。选取物件是相同的，会重复。控制物理、化学、生物学等因素；可以使用多种研究技术，记录方法。3.同时，可以提供很多重复性好、生物学特性相似的实验对象。4.可以作为制造生物产品、单克隆抗体生产及基因工程产品等的手段。缺点：人工模拟的条件与体内实际相比仍然存在很大的差异，在体外培养细胞后，长期生活在动态平衡不足的环境中，变化是不可避免的。体外培养比较孤立、比较单一，导致体内系统作用、神经体液调节及细胞相互作用的丧失，导致原始组织结构和细胞形态的变化、分化减弱或不显露的细胞单一化倾向。注意：体外培养细
3、胞是在一定条件下生长的细胞群，体外实验结果不能与体内实验结果完全相同！2节培养细胞生物学，1，体内外细胞分化的差异1。细胞增殖和分化：增殖增加细胞数。分化使身体的结构和功能多样化，最终演变成完整的有机体。接触抑制和密度抑制2。体外细胞的差异：细胞在体外培养后，失去神经体液调节和细胞之间的相互作用，就生活在动态平衡不足的环境中，变化是不可避免的。细胞出现最多的是返祖现象，即原始组织结构和细胞形态的丧失。分化减弱或显性，细胞单一化，不死性，恶性。即可从workspace页面中移除物件。第二，培养细胞的分化在体内时，其分化特性没有减弱或显现。例如，肝细胞失去了体外生成酪氨酸转移酶的特性。去分化(去分
4、化)使细胞不能因基因变异而分化。肝细胞失去精氨酸酶和氨基酸转移酶的特性，就失去了储存肝糖原的能力，很难再现。第三，培养细胞的形态1。附着型2。悬浮型，上皮细胞成纤维细胞型迁移细胞型多型细胞，大部分有机体细胞是粘附细胞。(1)上皮细胞(2)纤维成形细胞(3)移动型细胞(4)多势细胞，1，2，3，4，壁型细胞：需要附着在基质上生长的细胞称为壁型细胞附着。大部分有机体细胞在体内生存和成长的基本存在方式，细胞被放置在体外环境后，也必须粘在特定的固定表面，才能生存和生长，因此属于壁型细胞。现在，包括正常细胞和肿瘤细胞在内的许多种类的细胞可以在体外培养。纤维细胞、骨组织(骨和软骨)、心肌和平滑肌、肝、肺、
5、肾、乳腺、吡喃、神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞、各种肿瘤细胞等。，上皮细胞型名：来源于外胚层，内胚层细胞(个别例外):皮肤及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡，上皮瘤形态：体内上皮细胞扁平，不规则，有角的圆形核，生长特性与薄层相连，相互紧密连接，细胞群其中有椭圆形核，生长特性呈放射状排列，漩涡形状不接近片段，细胞细胞是容易分离但单独运动的独立成纤维细胞，拉伸了一些细胞，体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞，体外培养的平滑肌细胞(免疫组织化学染色显示肌动蛋白)，移动型细胞本型细胞在支撑体中分散生长，一般不绑在一起。 细胞质经常延伸出胃或突起，表示快速不规则地移动或变形运动。多型细胞多型细胞是一些形态上
6、不规则的细胞。该细胞一般分为细胞体和细胞突两部分。细胞石又细又长，像思想医生的脚。胞体是有点多边形，但没有成纤维细胞型的规则。在体外培养中，多型细胞出现的最常见类型是神经元和神经胶质细胞。注意：细胞形态不是固定不变的，而是根据培养条件、生长时间、细胞数量等而变化的，细胞形态只是对培养物质的判断或认识的基准指标。血清Hela高血清低血清成纤维细胞样上皮细胞pHHela太酸或太碱标准pH成纤维细胞密度3T3低密度高密度成纤维细胞样上皮细胞，悬浮细胞：培养时不附着基质，以悬浮状态生长或机械方式生长的来源：血液、脾脏或骨髓，特别是血液中白细胞肿瘤细胞特征：悬浮中生长良好的细胞圆形，具有容易收获的缺点：
7、观察不方便，精制不方便，离心死亡，活细胞分离，4，通过细胞生长和增殖培养细胞一代的生存时间，仅指从细胞接种到分离和培养的时间，这已成为培养工作中的一个习惯，与细胞第二代有着不同的意义。 细胞前一代可以将3-6代增加一倍。继代是将细胞从一个培养瓶盘转移到另一个培养瓶盘的过程。1.原代培养阶段或初级培养。从体内组织接种培养到第一次传承，根据组织长度，1-4w会有所不同。细胞结构和形态最接近体内，细胞群异质性，细胞分裂但不旺盛，克隆形成率下降。2 .继代培养阶段或继代培养。以细胞株为例，细胞增殖旺盛，普通细胞能延续10-50代。应在早期培养后期或传代初期冷冻保存细胞。传播频率或间隔以及培养基的特性。
8、接种数量与细胞增值速度有关。自由期内壁期潜伏期大生长期停止期(平胎期)，各代内壁细胞的生长过程，自由期：细胞接种后在培养液中保持悬浮状态。也称为悬浮期。此时细胞质收缩，胞体呈圆形。时间：10分1/4小时附着时间：细胞附着在基质上，自由时间结束。气质：玻璃、塑料、胶原蛋白、其他细胞等，潜伏期：细胞在没有细胞分裂的情况下进行生长活动。细胞系潜伏期一般为624小时。代数生长：细胞数随着时间的推移增加了一倍，产生得最多，最适合实验研究。停滞期(平台期):细胞填满瓶壁后，产生细胞但不再分裂的机制：抑制接触，限制密度，原代培养传代培养，选择生长良好的细胞，添加胰蛋白酶消化液，在镜子下观察，去除酶液，添加培
9、养液，反复吹制细胞悬浮液，按比例装扮减少期这个细胞仍然活着，但增殖期不会缓慢或增殖，细胞形态轮廓变大，最后细胞凋亡减少。3节培养细胞的生活环境和条件，细胞的营养要求：)基本营养素：氨基酸(谷氨酰胺)维生素葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子)细胞生长因子：大部分血清提供，细胞的生活环境)温度条件对细胞生长的影响其他生物源的组织细胞培养温度；在体外培养动物细胞最常用的温度是37。耐低温和高温！培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度超过43小时，细胞都会死亡。相反，温度不低于0时，会影响细胞代谢，但不会有害。在生理温度范围内，温度和细胞增长率之间存在正相关。)气象环境对细胞生长的影响动物细胞培养的气象环
10、境都是5%CO2和95%空气(供氧)的混合气体。参与2细胞的能量代谢过程。2用于维持培养液的ph值。一般开放培养，3)渗透正常渗透压力保持细胞张力，调节细胞代谢，一般细胞渗透压力为260320mmol/L。(4)培养液的ph值对细胞生长的影响大多数有机体细胞能在pH6.08.0环境中存活。最佳pH范围为7.27.4。体外培养的正常细胞的耐酸性比耐碱性强5)无污染，无毒(前提条件！)，3细胞常用的培养液和试剂培养液是维持组织细胞生存、生长、细胞培养各种工作所需的基本溶液。平衡盐溶液主要是培养基中其他培养用的液体、天然培养基、合成培养基、1)平衡盐溶液(balancedaltso 1 ution:
11、 BSS)，也称为食盐或盐溶液，主要由无机盐和葡萄糖组成。能够维持自身的渗透压，调节酸碱平衡的作用，同时提供细胞生存所需的能量和无机离子成分；用作清洗组织、细胞及各种培养用溶液。BSS包含少量酚红作为溶液ph值变化的指示剂；溶液呈酸性时，黄色，碱变时呈紫红色，中性时呈桃色，因此很容易观察培养液pH值的变化。多种常用平衡盐溶液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hanks、D-Hanks、Dulbecco(都有相应的配方)最简单的BSS是Ringer。D-Hanks和Hanks的主要区别在于它们不包含Ca2、Mg2，因此D-Hanks经常用于制造胰蛋白酶溶液。平衡盐溶液的制备还需要
12、使用新鲜的3蒸汽。平衡的盐溶液可以过滤杀菌或高温高压杀菌。浑浊或有沉淀物的情况下，phospate-buffer tedallines(PBS)、dulbeccosphospate-buffer tedallines(dpbs)标准、D-Hanks细胞培养基的基本要求：体外培养细胞直接生活在培养基中，因此培养基必须满足营养成分、生长促进因子、激素、渗透压力、pH等的细胞要求。培养基可以分为天然培养基、合成培养基。合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量人工合成的。设计了多种徽章，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质。目前常
13、用的MEMEagle培养液中只含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺、8种维生素，简单的成分能广泛适应各种完成的细胞株的培养。在此基础上，用两种培养液进行了改进，得到了广泛应用：BME (basialmediumeagle: BME)和DMEM(DulbeccoMEM)。合成培养基只能存活细胞，细胞生长繁殖，还需要补充一定量的天然培养基，如血清。合成培养基的优点：标准化生产、成分和含量相对固定，成本低。缺点：部分成分不足，不能充分满足体外细胞生长的要求。市场上干粉培养基和液体培养基干粉培养基的优点是用户必须亲自准备和灭菌。缺点是准备过程比较麻烦，质量不容易控制液体培养基。因为专业厂家按标准大规模生产，
14、不仅保证了质量，使用起来很方便，但是费用比较高。如何选择徽章？(1)用来制造特定细胞株的培养基，应该是培养细胞的首选培养基。(。(2)本实验室常用的培养基(3)细胞株特性，根据实验需要选择培养基(4)用多种培养基培养目标细胞。观察其生长状况，通过生长曲线、聚河形成速度等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基，培养基的准备(干粉培养基的情况)1。仔细阅读说明书。2.准备时保证充分融化，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解后添加。3.制造用的水必须是3蒸汽水，离子浓度很低，电阻超过30万。用的碗必须很干净。5.准备好的培养基应立即过滤，杀菌保存在4。DMEM培养液的制备(如(溶解)900
15、mLddH2O将1包DMEM粉末倒入1000mL燃烧器，将粉末压入50mLddH2O进行冲洗，倒入容器、磁力(或玻璃棒)溶解。(pH调节)使用0.22um滤膜，用7.2(添加抗生素)和绿色、链霉素的全部浓度100u/mL和100u/ml(过滤除菌)过滤PH。(保管化妆)化妆(200毫升左右)后保管4台冰箱。天然培养基中有血清(牛、马血清)、血浆、组织提取物(如鸡胚和牛胚胎提取物)、鼠尾胶原蛋白。优点：营养成分丰富，培养效果好的缺点：货源有限。成分复杂，影响部分实验产物的提取及实验结果分析。支原体污染细胞不能在简单的基础培养基中长期存活，基本培养基中经常加入血清，加入血清后，称为“完整培养基”。
16、血清的利与弊血清含有多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)。各种金属离子，激素；匹诺曹、冷球蛋白、胶原蛋白等促进附着的物质；多种生长因子；蛋白质传递；未知物质促进细胞黏附生长。血清中含有多胺氧化酶、补体、抗体、细菌毒素等有毒物质，这些物质会影响细胞的生长，甚至导致细胞死亡。各血清成分不能保持一致性。提取过程可能感染支原体或病毒，实验失败或结果不可靠。血清质量是实验成败的关键。常用牛血清燃烧血清(fetalbovineserum，FBS或fetalcalfserum，FCS)新生儿牛血清(newborncalfserum，NBCF):小于24h的小牛血清(calfserum)，血清使用及储存使用
17、前处理：血清使用前通常加热56至30分钟，此过程称为灭活。热灭活目的：消灭血清中的补体成分。优质的胎牛血清和新生儿牛血清可以直接用于细胞培养，而不考虑不灭。血清储存条件：血清一般储存在20，应避免重复冻融。大包装的血清首先消灭血清，分成10毫升、20毫升、50毫升等小包装，储存LONG8股份有限公司在-20中，使用前溶解。融化的血清不宜保存在第4期，应尽快使用。血清内沉淀物絮：血清内脂蛋白变性及解冻后血清内纤维连接蛋白，不影响血清本身的质量。离心力3000rpm，5分钟去除或没有显微镜的情况下，“小黑点”:热处理的血清中沉淀物的形成可能显着增加。显微镜下看起来像“小黑点”的沉淀物也经常被误认为血清被污染了。一般来说，这个小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清的质量，就要立即停止使用，更换其他批次的血清，通常含有5牛血清的培养基是成对的
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