卵巢癌（OC）仍然是女性中最常见的癌症，具有高发病率和死亡率，促使在体内、体外和临床环境中进行广泛研究。在此背景下，体外细胞培养模型已被广泛用于研究药物反应、肿瘤进展以及新型治疗策略的开发。其中，三维（3D）培养系统已成为能够更准确重现肿瘤复杂性的先进平台。同
卵巢癌（OC）仍然是女性中最常见的癌症，具有高发病率和死亡率，促使在体内、体外和临床环境中进行广泛研究。在此背景下，体外细胞培养模型已被广泛用于研究药物反应、肿瘤进展以及新型治疗策略的开发。其中，三维（3D）培养系统已成为能够更准确重现肿瘤复杂性的先进平台。同时，对补充性治疗方法的探索，特别是天然产物，因其在增强抗肿瘤功效的同时减少不良反应的潜力而受到关注。在这篇诠释性叙述性综述中，研究人员研究了3D培养模型在评估天然化合物对OC效果中的应用。基于21项选定研究，研究人员强调，3D系统，包括通过悬滴法、超低吸附板、包被表面、水凝胶和旋转培养形成的球体，能够实现更生理相关的肿瘤微环境建模。在这些系统中，多种天然化合物（例如，表没食子儿茶素没食子酸酯、醉茄素A、番茄红素、葫芦素、染料木黄酮等）一致地表现出抗肿瘤活性。这些效应包括抑制迁移和侵袭、诱导凋亡、调节氧化和炎症途径以及破坏细胞-基质相互作用。在机制上，这些天然化合物靶向参与肿瘤进展的关键信号通路，尽管在标准化、可重复性和临床转化方面仍存在显著空白。重要的是，本综述强调了3D体外模型在重现肿瘤生物学方面的优越性，并突出了天然产物作为常规疗法辅助策略的有前景作用。总的来说，这些发现为推进旨在改善OC治疗结局的实验、转化和临床研究提供了坚实的框架。
卵巢癌（OC）在女性癌症中死亡率最高。它是女性第八大常见癌症，占2020年病例的约3.7%和癌症死亡的4.7%[1]。全球范围内，它是第18大常见癌症类型，2026年预计有21,010例新病例，其中约12,450例死亡。其侵袭性加上早期诊断困难（影响高达80%的晚期患者）使其成为世界上最致命的癌症之一，五年相对生存率较低[2], [3]。晚期诊断与症状的非特异性有关，包括腹痛和胃肠道紊乱，如呕吐、恶心、便秘和腹泻[4]。该疾病最常在55至64岁之间的女性（更年期）中被诊断，但其他风险因素包括未产（从未生育）、子宫内膜异位症、肥胖、吸烟，尤其是家族史[5]。考虑到其无症状进展和通常晚期诊断，用于检测OC的方法包括体格检查、常规经阴道超声、血清CA-125标志物（一种广泛用作卵巢癌和子宫内膜癌肿瘤标志物的蛋白质）检测以及患者家族史的详细评估[6]。鉴于这种情况，投资于联合治疗策略以及寻找更接近肿瘤微环境真实条件的实验模型变得越来越重要[7]。长期以来，二维（2D）模型一直是癌症研究的基础，主要是因为其维护简单且成本较低，正如Edmondson等人[7]所指出的。然而，它们存在相当大的局限性，例如难以再现细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，以及无法模拟真实肿瘤中存在的氧气和营养物质梯度[8]。3D模型，如球体和类器官，通过更忠实地再现肿瘤结构、缺氧区和细胞异质性，克服了其中一些障碍，使体外数据更接近体内观察到的条件[9]。在此背景下，3D培养在OC研究中的应用日益突出，因为它可以更现实地研究复发和腹膜转移相关的过程，模拟在腹水中观察到的球体形成，这是高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的一个显著特征[10]。考虑到这种方法，对使用天然生物分子作为治疗方案的潜在辅助手段的兴趣日益增长。例如，姜黄素在使OC细胞对顺铂等化疗药物敏感方面显示出前景，并在细胞培养系统中呈现出一致的结果[11], [12]。因此，正如多位作者所讨论的，天然化合物与3D模型的结合是增强治疗效果和应对获得性耐药的相关策略。
在癌症研究中，细胞培养是最基本的实验方法之一。然而，除了仅仅研究肿瘤细胞，提供足够的环境来模拟细胞间通讯以及所采用的代谢系统至关重要。2D细胞培养因其简单、成本低且适用于常规功能测定而仍被广泛使用。在这些系统中，细胞作为单层附着在培养瓶或平皿的塑料表面上生长[7], [13], [14]。然而，这种人工形式存在重要局限性，损害了其生理代表性。首先，在2D中生长的细胞不能充分再现组织或肿瘤的3D结构。细胞与ECM之间的复杂相互作用，对于分化、增殖、活力、基因和蛋白质表达、药物代谢和刺激反应等过程至关重要，在此背景下并未得到良好体现[15], [16], [17]。将细胞从组织分离到二维环境会导致形态改变和细胞分裂模式的变化，并导致多种细胞表型的丧失[15], [16], [18]。这些改变对细胞功能产生负面影响，重组细胞内结构，并影响分泌机制和信号传导[8], [19], [20]。此外，与外部微环境相互作用的干扰导致细胞极性丧失，从而显著改变对凋亡等现象的反应[8], [21], [22]。另一个限制因素是细胞对培养基成分（如氧气、营养物质、代谢物和信号分子）的无限制接触。这种情况与体内肿瘤的现实形成对比，在体内由于组织的结构复杂性，这些元素分布不均[23]。多项研究表明，2D培养深刻改变了基因表达、剪接、拓扑结构和细胞生物化学[16], [24], [25], [26]。此外，贴壁培养通常是单一培养，这阻碍了肿瘤微环境和支持肿瘤起始细胞的细胞生态位的建模[27], [28], [29]。
增强化疗疗效的一种新兴策略是使用天然产物及其衍生物。多种天然产物存在于癌症研究和治疗中，已有大量已发表的文献探讨其功效、机制和临床相关性。这些天然化合物可分为几个主要类别，如黄酮类、生物碱类、萜类和多酚类[30]。例如，紫杉醇（Taxol）是最重要的化疗药物之一，在全球范围内广泛用于一线癌症治疗，源自太平洋紫杉树皮[31]。长春花生物碱因其抗癌特性已被用于治疗白血病、淋巴瘤、乳腺癌。总之，药用植物中的生物活性化合物提供广泛的药理效应，可用于癌症治疗和预防。正在进行的研究继续揭示这些化合物的全部潜力，为开发新的有效治疗药物铺平了道路[30]。将3D OC模型与天然产物相结合，为开发新型治疗策略提供了一种有价值的药理学和转化方法。例如，Holzapfel等人[32]使用单层和球体培养研究了番茄红素的效果，而El-Senduny等人[33]在悬滴3D OC模型中证明了葫芦素B的抗肿瘤活性。尽管这些和其他研究强调了天然化合物与先进3D培养系统相结合的潜力，但目前仍缺乏对现有证据的全面、标准化合成。考虑到越来越多地使用体外模型来研究药物反应、肿瘤进展和替代治疗方法，这一空白尤其重要。因此，需要整合三个关键方面：（1）天然产物的治疗潜力；（2）开发更生理相关、能更好模拟肿瘤微环境的3D培养系统；（3）它们在OC研究中的应用。因此，本叙述性综述提供了当前3D培养模型的综合概述，特别强调了它们在评估天然产物作为潜在OC治疗药物方面的应用。本综述的主要概念框架总结于图1。
本叙述性综述通过对涉及3D细胞培养模型、OC和天然产物的文献进行批判性和诠释性分析而进行。在PubMed数据库（）中进行了系统检索，应用了预定义的检索词和布尔运算符：I-（“OC”）和（“3D”或球体*或类器官*）和（“天然产物*”或植物化学物质*或“植物提取物*”）和（体外或培养或测定）；II-（“卵巢肿瘤”）和（“3D细胞培养”或类器官*或球体*）和（“药用植物”或“植物化学物质”或“中草药”），限制在2012年至2025年的出版物。此外，研究过程中建议的稿件也根据纳入和排除标准进行了评估。纳入标准包括使用体外分析研究OC的研究，从不同方法学角度进行3D细胞培养形成球体，以及在这些实验模型中检查天然产物效果的研究。排除标准包括综述文章、比较文章、预印本、撤回出版物以及仅涉及未在3D基质内组织的移植类器官的研究或关于其他类型癌症和2D模型的报告。使用MCEA分析了总共172篇稿件，并得到所有合著者的同意。稿件在Excel电子表格中整理，并针对标准逐一评估。根据上述标准（例如，综述、2D模型）排除稿件，并去除重复项。应用这些标准并经所有作者达成共识后，共纳入21项研究。图2总结了综述方法和结果的工作流程。决定不使用PRISMA协议与本工作的范围一致，该工作提出了对3D细胞培养技术在卵巢肿瘤生物学背景下的优势方面以及天然产物如何从药物治疗角度发挥作用的复杂、综合和描述性观点。此外，叙述性综述的范围允许对当前局限性进行批判性解释，识别知识空白，并讨论不仅限于临床前和实验性的，还包括转化和临床的未来前景。
该系统可通过多种技术生成；在此，我们重点介绍涉及天然产物和OC研究中应用的一些主要方法。
该技术依赖于重力强制自组装[34]。在这种方法中，制备浓缩细胞悬液，将小液滴（通常10-20 μL）小心地移液到培养皿倒置的盖子上。培养皿底部用作湿润气氛。在37°C、5% CO2培养下，重力促进细胞聚集在悬滴底部，在24-48小时内自发形成球体。该方法可形成均匀、无支架的3D细胞聚集体，并可适用于共培养或以最小体积测试可溶性化合物[35]。最近，与标准多孔板格式兼容的专用悬滴阵列板通过启用自动化液体处理和高通量筛选，扩展了传统悬滴方法的适用性[36]。在Kelly等人[37]进行的研究中，使用悬滴法从CAOV-3细胞系生成OC球体。此外，研究人员通过将这些细胞与来自网膜的干细胞共培养，开发了混合类器官，模拟了更复杂和生理相关的肿瘤微环境。两种模型均用于评估天然表观遗传化合物，单独使用或与标准化疗联合使用。类似地，Hossein等人[38]通过悬滴法（20%甲基纤维素）制备SKOV-3多细胞肿瘤球体（MCTS），并转移到琼脂糖包被的板中。该模型用于确定STAT3活性与半乳糖凝集素-3（Gal-3）之间的关系，并研究PectaSol-C改性柑橘果胶（Pect-MCP）作为Gal-3特异性竞争性抑制剂与紫杉醇（PTX）联合使用对MCTS的细胞毒性。为确保一致性并避免坏死区，分析使用了直径小于200 μm的球体。在另一项研究中，使用悬滴法从A2780CP细胞系生成3D球体，并用葫芦素B、顺铂单独处理，或用葫芦素B预处理后暴露于顺铂。该研究评估了细胞活力、细胞周期进程、凋亡，以及活性氧（ROS）和总谷胱甘肽水平[33]。总的来说，悬滴技术被认为是一种简单且经济高效的球体生成方法，因为它不需要专用设备或外源性支架[35]。然而，传统的悬滴方法仍然劳动密集，需要小心手动操作，特别是在更换培养基时，这可能会限制长期培养和大规模应用，除非使用专用平台[39], [36]。相反，它与共培养系统的兼容性允许纳入多种细胞类型，从而提高了模型的生理相关性，并可能增加其转化潜力[37]。
除了悬滴法，其他方法也已用于生成OC球体，包括使用超低吸附（ULA）板。该技术依赖于防止细胞粘附到培养表面，迫使细胞自发聚集和形成球体[40]。Justino等人[41]制备了封装巴西红蜂胶提取物（BRPE）的聚合物纳米颗粒，并测试了其针对OC细胞OVCAR-3球体的功效，与游离BRPE提取物的作用进行了比较。他们使用ULA板加0.5%（v/v）甲基纤维素来生成OVCAR-3细胞的球体。此外，还使用离心法诱导细胞彼此聚集。然后将所得球体用于评估游离BRP提取物和负载BRP的纳米颗粒（NC-BRPE）的细胞毒性效应。在3D中，根据IC50，NC-BRPE（137.2 μg/mL，6.5 × 1010NC-BRPE/mL）比游离BRPE（175.1 μg/mL）效率高约1.3倍。虽然ULA板比传统细胞培养板更昂贵，但由于其简单性、可重复性和与标准实验室工作流程的兼容性，它们已成为最广泛使用的球体生成平台之一。目前商业化的ULA板有多种格式（例如96孔和384孔板），便于自动化液体处理、高内涵成像和高通量药物筛选[42]。尽管其在球体形成方面具有一致性，但不同商业ULA板的孔几何形状和表面特性差异可能会影响球体大小、形态和细胞行为。因此，板的选择和方案优化对于确保实验一致性和促进研究间比较仍然很重要[42]。总的来说，ULA板为生成均匀球体提供了标准化和可扩展的平台，使其特别适用于自动化成像、大规模药物筛选和临床前癌症研究。通过促进可重复的球体形成，同时保持与常规实验室基础设施的兼容性，它们也为体外肿瘤建模提供了高转化相关性。
包被孔涉及在细胞接种前将特定底物施加到培养板底部。这些包被材料调节细胞-表面粘附，通过依赖细胞-底物相互作用的机制实现3D结构的形成LONG8股份有限公司[43]。用于包被孔底部的材料可能包括复杂的组织衍生基质，如Matrigel和Geltrex，天然生物分子，如ECM蛋白（I型和IV型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白）；或合成和半合成聚合物，如琼脂糖，它被广泛用作非粘附性包被，以促进OC模型中3D结构的形成[44], [45]。复杂基质提供丰富且具有生物活性的3D环境，而ECM蛋白促进细胞粘附并更好地模拟生理微环境。相比之下，合成聚合物调节细胞粘附，如聚赖氨酸增强粘附，而聚HEMA减少粘附[46], [47]。包被材料的选择取决于实验目标和所研究细胞系的特点[48]。多年来，多项研究证明了该技术在癌症生物学研究中的适用性。使用基底膜基质包被孔系统的一个经典例子是Debnath等人[49]描述的MCF-10A模型，其中乳腺上皮细胞在3D培养于Matrigel或富含层粘连蛋白的基质上时形成极化的腺泡结构。这些结构表现出上皮形态发生的关键特征，如顶-基底极性和管腔形成，这些在传统2D培养中不存在[50]。在OC中，富含ECM的基质如Matrigel和I型胶原被广泛用作孔或膜包被，以生成重现腹膜播散和与网膜基质（OC在腹腔内的主要转移部位）相互作用的类器官和肿瘤模型[51], [52]。此外，患者来源的HGSOC类器官模型已被用于重现原始肿瘤的基因组和功能特征，在基质依赖的3D环境中培养[53]。尽管包被孔在使用前需要额外的包被步骤，但它们代表了一种相对可及且通用的球体生成方法。然而，可重复性取决于包被程序的一致性，因此仔细优化方案对于最小化实验变异性并确保可靠的球体形成至关重要。总的来说，基于包被孔的3D培养为OC研究提供了一个生理相关的平台，特别是因为它们更好地模拟了对于重现肿瘤微环境至关重要的ECM衍生信号。因此，这些模型非常适合机制研究和治疗化合物的评估，尽管标准化包被方案对于提高研究间的可重复性仍然至关重要。
水凝胶已成为用于癌症建模的高度通用且具有细胞相容性的生物材料，因为它们提供具有可调特性（如孔隙率、形状、可降解性、刚度和生化组成）的水合微环境，密切模拟体内观察到的ECM[LONG8股份有限公司54]。这些系统促进细胞自组织，并与传统2D培养相比，实现更生理相关的细胞-基质和细胞-细胞相互作用[55]。在此背景下，水凝胶可分为天然、合成、混合或自组装系统，其机械性能不仅在培养过程中维持结构稳定性方面起关键作用，而且在调节细胞机械转导方面也起关键作用，从而影响关键的细胞行为，如迁移、增殖和分化[56], [57]。基于水凝胶的3D培养系统依赖于将肿瘤细胞包裹或嵌入高度水合的聚合物网络中，这些网络模拟天然ECM的生物物理和生化特性。在典型方案中，OC细胞以特定密度（例如，1-5 × 106cells/mL）重悬于冰冷或液态预凝胶溶液中，该溶液可能由天然聚合物组成，包括胶原、藻酸盐、基底膜提取物或补充有细胞粘附肽的合成基质[55], [58], [59]。然后将细胞-水凝胶混合物作为小液滴分布或浇铸到模具或培养孔底部，然后通过热、离子、酶或光化学交联进行凝胶化，具体取决于聚合物化学性质。聚合后，将构建体覆盖上完全培养基并进行培养，允许细胞在3D基质中扩散、增殖并自组织成球体或类器官样结构，时间周期各异。通过调整聚合物浓度、交联剂密度和生物活性基序的掺入等参数，可以精确控制水凝胶的刚度、孔隙率和可降解性，这反过来又调节OC细胞的球体大小、侵袭行为和药物反应。此外，水凝胶嵌入的球体随后可通过酶促或螯合剂介导的基质降解回收，从而实现下游分析，如流式细胞术、转录组学和高内涵成像[54], [60], [61]。总的来说，积累的证据表明，基于水凝胶的3D培养平台比传统2D系统具有显著优势，因为它们更忠实地再现了组织微环境的机械和结构线]。底物刚度和组成的差异直接影响细胞表型、药物反应和机械记忆，可能导致在刚性表面培养中未观察到的行为。水凝胶的可调性允许研究人员根据每项研究的目标来调节这些参数。然而，这种多功能性也代表了一个重要的局限性，因为水凝胶组成、交联方法和机械性能的变化可能显著影响细胞行为、药物反应和实验可重复性[64]。因此，仔细优化和标准化水凝胶配方对于确保可重复的结果和促进研究间比较至关重要。尽管存在这些挑战，基于水凝胶的系统仍然是用于研究肿瘤生物学和评估治疗策略以减少实验偏差并弥合体外发现与体内生理条件之间差距的最具转化相关性的体外平台之一[16], [64]。
旋转细胞培养系统（RCCS）是一种动态的3D培养平台，模拟低剪切、微重力样的环境，允许细胞在改善营养物质和氧气扩散的条件下生长并自组装成球体[65], [66]。使用这种方法，OVCAR-10 OC细胞在低剪切条件下培养以生成球体[67]。在转速为8 rpm、初始接种量为1 × 107个细胞时实现了最佳球体形成，在五天内形成均匀的聚集体。这些培养条件产生的结构更接近体内肿瘤结构。该模型随后用于评估Oplopanax horridus（魔鬼俱乐部）提取物及其生物活性化合物单独或与化疗药物联合使用的抗增殖作用。值得注意的是，在RCCS系统中生成的球体比传统2D单层培养表现出更强的治疗抵抗力，凸显了该模型重现肿瘤抵抗力和微环境复杂性关键特征的能力。总的来说，RCCS系统提供了一个动态环境，能够生成比许多静态培养方法更大、更生理相关的球体。这些特性使该模型对于研究肿瘤进展、耐药性和长期细胞反应特别有价值[68]。然而，对专用生物反应器设备的要求以及仔细优化转速和培养条件的需要，可能限制了其在常规实验室环境中的可及性。因此，尽管旋转系统通过更好地模拟肿瘤微环境的动态条件而具有相当大的转化相关性，但其实施仍比传统静态3D培养平台在技术上更具挑战性。特别是，3D培养模型通过比传统2D系统更忠实地再现天然组织结构和微环境，改变了生物医学和临床研究（尤其是肿瘤学），从而增强了实验结果的生物学相关性。这些模型允许细胞在所有空间维度上组织自身，促进细胞之间以及细胞与ECM之间的现实通信，从而更近似地阐明体外分子、生化和肿瘤反应行为[69], [70]。3D模型更大的生理相关性体现在肿瘤结构和生理特征的近似上，如缺氧区域、代谢异质性和信号通路的激活。例如，OC球体表现出改变的基因表达谱，富含上皮间质转化（EMT）标志物、缺氧和耐药性，这在2D培养中未观察到[69], [70]。这种表型改变对于理解OC中常见的化疗耐药机制至关重要，特别是在HGSOC中，铂类化疗仍然是主要的临床挑战[39]——这最后一点也凸显了这些技术的相关性。图3总结了OC研究中应用的主要3D培养方法。
天然化合物的使用已被探索作为OC治疗的补充策略。近年来，这些化合物与3D体外模型的整合越来越受到关注，因为3D平台比传统2D培养更准确地重现肿瘤结构、细胞-细胞相互作用和微环境。在此背景下，3D OC模型越来越多地被用于不仅评估细胞毒性，还研究对肿瘤异质性、癌症干细胞（CSC）维持、EMT和治疗抵抗的影响。这些模型为识别生物活性天然产物和阐明其在更好反映体内肿瘤行为的条件下的作用机制提供了更生理相关的框架。以下章节审查了在3D培养系统中评估的天然产物，强调了平台选择如何影响对生物学反应的解释，并增进了对其在OC中抗癌潜力的理解。
Kelly等人[37]使用了OC的3D模型，包括通过悬滴法生成的CAOV-3球体以及与网膜来源干细胞共培养的类器官，来研究天然表观遗传化合物的效果。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），一种从绿茶中提取的多酚，是一种强效抗氧化剂和DNA甲基转移酶抑制剂，具有针对多种癌症类型的抗肿瘤特性[71], [72]。类似地，吲哚-3-甲醇（I3C），一种天然组蛋白去乙酰化酶抑制剂，存在于西兰花等十字花科蔬菜中，也已显示出抗肿瘤活性[73]。在此背景下，研究人员测试了EGCG和I3C，证明两种化合物均能显著抑制3D肿瘤生长，并减少侧向扩散、迁移、侵袭和处理后的细胞活力，其抗肿瘤效果与合成药物帕比司他相当。在人外植体中也观察到肿瘤分泌组的调节，促肿瘤细胞因子和ECM成分减少，表明对肿瘤微环境动态产生了直接影响。还评估了天然和合成表观遗传化合物与顺铂和PTX标准方案在OC球体和类器官中的疗效。虽然化疗处理将球体中的肿瘤生长减少了高达67%，类器官中减少了75%，但表观遗传化合物，无论是单药治疗还是与化疗联合，都促进了更优越和更持久的抑制。特别是，用EGCG或I3C处理的组显示出更少的肿瘤细胞侧向扩散，以及处理后再生成能力的更显著降低。分泌组的调节和与肿瘤进展相关过程的抑制表明，这些化合物发挥多因素效应，这在球体和类器官等生物学复杂模型中可能代表显著优势。基于肿瘤球的3D培养已被用于研究与OC中肿瘤侵袭性和干细胞样特征相关的基因表达程序[74]。使用ES-2细胞，在ULA板中从贴壁单层生成的肿瘤球表现出明显的转录重编程，其特征是干细胞标志物（NANOG和PROM1/CD133）和EMT相关基因（SNAI1、SNAI2和纤连蛋白）表达增加，同时细胞骨架成分如ACTB的表达降低。肿瘤球形成还与促存活通路的激活相关，包括抗凋亡蛋白（BCL-2、BCL-XL）上调和AKT磷酸化，增强了在3D培养中观察到的增强抗性。重要的是，使用表观遗传调节剂EGCG处理选择性减弱了与肿瘤球形成和干细胞样特性相关的基因表达，同时抑制了促存活信号并促进了凋亡，如BCL-2/BCL-XL表达降低、AKT磷酸化减少和cleaved PARP水平增加所证明。作者得出结论，EGCG在3D肿瘤球形成过程中，在转录和信号水平干扰了CSC样和存活相关特征的获得。
在类似背景下，中国杨梅叶原花青素（BLPs），一类以表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯为末端和主要延伸单元而富集的多酚化合物，已使用基于球体的3D模型研究其针对OC干样细胞的活性。Zhang等人[75]使用第三代化疗耐药的OVCAR-3球体（使用ULA板生成）来评估BLPs对CSC相关特性的影响。BLP处理显著降低了细胞活力并诱导了G1期细胞周期阻滞，伴随着细胞周期蛋白D1的下调。重要的是，BLPs损害了球体和集落形成能力，表明抑制了自我更新潜力。在机制上，这些效应与WNT/β-catenin信号通路的抑制相关。BLP暴露增加了GSK3β表达，促进β-catenin磷酸化，并因此降低其转录活性，导致关键靶点如c-MYC和细胞周期蛋白D1的下调。与干细胞样特征抑制一致，BLPs显著降低了ALDH阳性细胞（OC干细胞的功能标志物）的比例，以及干细胞相关转录因子（包括OCT4和SOX2）的表达。总的来说，这些发现强化了基于球体的3D培养系统在揭示富含多酚的天然化合物在OC中靶向CSC效应方面的价值。
两种夹竹桃科药用植物提取物，Pao Pereira（来自亚马逊树种Geissospermum vellosii）和Rauwolfia vomitoria（原产于非洲的热带灌木），在单层和3D球体模型中对卵巢CSC群体的影响进行了研究[76]。通过肿瘤球体形成实验和CSC相关表面标志物的表达评估了CSC富集。用Pao和Rau处理显著降低了多个OC细胞系（OVCAR-5、SHIN3、OVCAR-8和SKOV-3）中的CSC群体，同时对非致瘤性卵巢上皮细胞系HIO80表现出较低的细胞毒性，提示一定程度的肿瘤选择性。在3D背景下，两种提取物均显著抑制了在ULA板中生成的SKOV-3球体，IC50值比在总体肿瘤细胞中观察到的低四倍以上，表明优先靶向CSC样群体。一致地，Pao和Rau在24和48小时显著降低了CD44+CD117+亚群，支持其抗干性活性。在机制上，这些效应与WNT/β-catenin通路的抑制相关。Pao（100 μg/mL）在24和48小时减少了核β-catenin而不影响其胞质水平，而Rau诱导了时间依赖性降低，在48小时更明显。这些发现表明，两种提取物通过抑制β-catenin依赖性转录来损害卵巢CSC的维持。尽管CSC抑制的精确分子机制仍有待完全阐明，但数据提示WNT/β-catenin信号是这些提取物的潜在核心靶点。未来的研究将Pao或Rau与选择性WNT/β-catenin通路抑制剂相结合，可能有助于进一步描绘其作用机制并增强其转化相关性。
番茄红素存在于西红柿、木瓜和西瓜等水果和蔬菜中，属于类胡萝卜素家族，这是一类被广泛研究具有抗癌特性的化合物。Holzapfel等人[32]使用基于明胶甲基丙烯酰胺-透明质酸（GelMA-HA）水凝胶的3D培养系统生成的OC球体，评估了以碳水化合物基质配制的番茄红素（10%番茄红素）的效果。用番茄红素（0.5-5.0 μM）处理以时间和剂量依赖性方式调节细胞行为。在OV-MZ-6细胞中，增殖和活力在第7天保持相对稳定，14天后观察到活细胞数量适度增加。相比之下，SKOV-3细胞在0.5 μM番茄红素处理后第7天表现出增殖和活力的显著降低。总的来说，在0.5、1.0和5.0 μM浓度下观察到对细胞活力的最显著影响。这些发现表明，番茄红素在OC球体模型中发挥背景依赖性效应，包括早期抗增殖活性。虽然这项研究支持番茄红素的潜在抗肿瘤特性，但需要进一步的研究——特别是那些纳入标准化方案和临床验证的研究——来确定其治疗相关性。
醉茄素A（WFA）是一种甾体内酯，属于醉茄内酯类，从药用植物南非醉茄（Withania somnifera）中分离得到。该化合物因其抗炎、抗增殖和促凋亡特性而被广泛研究，在多种肿瘤类型中显示出抗癌活性[77]。Fong等人[78]进行的一项研究评估了阿霉素（Dox）与WFA单独或联合使用对OC细胞系A2780和CAOV-3以及顺铂耐药细胞系A2780/CP70的效果。Dox/WFA联合用药比单独用药更显著地抑制了肿瘤增殖，增加了活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）水平，产生了DNA损伤、自噬体形成以及由LC3切割caspase介导的信号传导，导致细胞死亡。研究人员还在小鼠中进行了相同的Dox和WFA处理，进行了体外3D肿瘤和体内异种移植模型，验证了所有处理中的肿瘤抑制，特别是联合用药时（高达80%抑制）。这些处理诱导了肿瘤细胞的自噬、细胞死亡和DNA损伤，由LC3B-caspase 3介导。这项研究为通过活性物质与WFA联合治疗耐药或非耐药OC提供了重要基础，此外还展示了其最小化/消除不良反应的潜力[78]。尽管这些发现很有价值，但该研究探索了与3D培养相关的有限过程，并且方法学细节描述不足，这限制了其作为进一步研究基础的有用性。该模型采用了相对简单的肿瘤球体，生长在Matrigel或类似基质上，缺乏对准确重现肿瘤微环境至关重要的基质和血管成分的纳入。未来的研究应通过采用更先进、标准化的3D平台来解决这些局限性，这些平台整合了动态的肿瘤-基质元素；这将捕捉肿瘤细胞在生理相关条件下的异质性行为。
Verticillin是一种从真菌中分离的表聚硫二酮哌嗪生物碱。使用体外2D和3D策略、LCMS和药代动力学研究，Kaweesa等人[79]最近评估了verticillin化合物（琥珀酸酯A和D）在人OC细胞（OVCAR-4、OVCAR-8和HGSOC）中的治疗能力，并记录了凋亡诱导和肿瘤缩减。值得注意的是，该研究还使用了腹膜腔中的OVCAR-8异种移植模型，描述了肿瘤缩减以及纤维蛋白粘连、纤维蛋白化脓性腹膜炎和与两个最高剂量verticillin琥珀酸酯A相关的胰腺炎。作者强调的一个局限性是与verticillin D在体内模型中相关的肝毒性，表现为严重的肝脏形态损伤和器官融合。在较高剂量下，处理过的小鼠还表现出中性粒细胞增多、γ-谷氨酰转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素水平升高，以及碱性磷酸酶活性降低。尽管有不良反应，该研究提供了关于verticillin对HGSOC细胞系细胞毒性作用的重要见解，并支持其抗肿瘤潜力。然而，观察到的毒性——特别是verticillin D——是一个显著的局限性。因此，从细胞和生化角度来看，该化合物显示出有前景的活性，但需要进一步研究来优化配方和稳定性、减轻毒性并确定安全有效的剂量策略。
斯卡洛林碱（SCO），一种从Croton flavens、Corydalis dubia和Corydalis cava中发现的苄基异喹啉生物碱，被研究其减弱OC球体中干细胞样特征的能力[80]。使用OVCAR-3细胞，SCO处理以剂量依赖性方式降低了细胞增殖，而在IC50浓度下处理48小时后不影响HEK293细胞的活力，表明对癌细胞的选择性细胞毒性。在肿瘤球形成实验中，OVCAR-3细胞首先暴露于SCO（5和10 μmol L?1，48小时），然后仅将活细胞接种到ULA板中，在干细胞选择条件下生成初级和次级肿瘤球。SCO处理显著减少了球体的数量和大小，初级球体减少58.4 ± 6.1%，次级球体减少93.5 ± 3.1%。然而，作者没有指定球体定量的大小标准，这可能限制了分析的稳健性。SCO还下调了间充质和干细胞相关标志物，包括N-cadherin、vimentin、CD44、Oct-4、Sox-2和Aldh1A1，同时上调了上皮标志物如E-cadherin和CD24。功能实验进一步证明了集落形成能力、迁移和侵袭的降低。在机制上，SCO降低了PI3K（p85）、p-AKT和p-mTOR水平，而不改变总AKT或mTOR表达，表明抑制了PI3K/AKT/mTOR信号轴。一致地，体内研究显示OC小鼠模型中肿瘤体积和质量减小，支持了SCO在3D OC模型中靶向干细胞样相关通路的潜力。
蜂胶是一种天然辅助治疗产品，来源于植物树脂和蜜蜂分泌物，其特征在于复杂的植物化学成分组成，富含酚类化合物、黄酮类和萜烯，这构成了其多种生物活性的基础，包括抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用[41], [81]。巴西红蜂胶提取物（BRPE）的抗肿瘤潜力以其游离形式以及封装入聚合物纳米颗粒（NC-BRPE）中进行了评估，以改善稳定性和递送效率，针对OVCAR-3细胞，比较了2D单层培养和3D球体中的结果[41]。3D球体使用ULA板补充0.5%甲基纤维素促进聚集，然后离心以确保球体紧密形成。细胞毒性在处理24小时后通过中性红（NRA）和刃天青还原（RRA）实验（用于2D培养）以及CellTiter-Glo
（用于3D球体）进行评估。这些实验在其代谢依赖性上有所不同——NRA依赖于溶酶体活性，而RRA依赖于线粒体对刃天青的还原——允许对细胞活力进行互补评估。BRPE和NC-BRPE均显示出剂量依赖性细胞毒性，纳米封装通过降低IC
值（NRA中约2倍，RRA中约1.5倍）增强了功效。空的纳米载体无细胞毒性，且在低剂量下轻微促进增殖，而实验差异可能反映了BRPE诱导的线D培养中，尽管存在球体相关的耐药性，NC-BRPE仍保持了优异的活性，并诱导了部分解聚，表明