开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶
液/试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、
有效期是否符合要求。合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。复苏、换液用液体：
(1)融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1°C含%新洁尔灭溶液。
辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞
辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管
依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将
其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无
辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。操作人员将培养瓶（T175）盖打开，
倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：〜ml/cm2）,拧紧
依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。本操作规格按复苏1支细
胞种子到1个T75cw瓶规定各项操作。若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作
种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种
子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致。核对无误后，迅速全部浸入39±1°C含%
新洁尔灭溶液（1000ml/支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1
分钟内。然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗内风淋2分钟。同时马上通知
细胞区人员将种子从传递窗取走。迅速传递并浸入百级内±1C含%新洁尔灭溶液中，百级
操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到
辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置
将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩内用75%酒精消毒，
换液前准备与复苏前相同。观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及
瓶塞。操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流
至废液缸。辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上
待用。操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加
开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流
检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期内。检查本次操作所用溶液/
试剂瓶内是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期
细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、％NaHCO
辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶
打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：
30ml/T75cm2瓶。（加量：〜ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日
辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶
盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ml
/cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞
消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要 45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化 细
辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养
瓶打开，用吸管吸10ml 至T75 cm2 瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞 悬
操作人员将细胞悬液平均分种至2 个T175 cm2 培养瓶中，，加生长液至75ml。
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2 个T175 cm2 细胞培养
向 MEM 中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、％膈俱。辅助人员盖紧
辅助人员将PBS 打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶
打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：
60ml/T175 cm2 瓶。（加量：〜ml/cm2）盖上盖子，PBS 交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、 日
辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶
盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸7ml 细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ml
/cm2）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞
消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要 45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化 细
辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养
瓶打开，将生长液直接倒入至 T175 c 血瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打
操作人员将细胞悬液平均分种至8 个T175 cm2 培养瓶中，加生长液至75ml。
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种
辅助人员先用酒精棉球外焰消毒 MEM 桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸
向 外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松
动， 一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近
创造无 菌环境。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，
加完后 混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。
注意事项：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位（除吸管后端的任何位置），如不慎
辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将培养瓶
打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：
60ml/T175 cm2 瓶。（加量：〜ml/cm2）盖上盖子，PBS 交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、 日
辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。同时将培养瓶
盖子打开交由操作人员。操作人员用吸管吸7ml 细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：~ml
/cm2 ）盖好瓶盖。辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。操作人员翻转培养瓶，使细胞
消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要 45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。室温消化 细
辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。操作人员将消化好的培养
瓶打开，将生长液直接倒入至 T175 c 血瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打
分散，制成均匀的细胞悬液。然后将8 个培养瓶的细胞合并到1 个T175 cm2 瓶中。用传液 管
辅助人员将 10 层细胞工厂盖子打开，操作人员将连接管道出液口处的细胞工厂转接头
无菌取出后与细胞工厂左端口对接，并将细胞工厂横放在操作台上，同时将细胞工厂右端的
盖拧松。辅助人员真空泵打气端与管道空气滤器相连，开启真空泵将生长液打入细胞工厂内。
结束后，操作人员用止血钳将管道夹紧后将细胞工厂右端的盖拧紧，平衡后把细胞工厂向上
直立，再取下左端的连接细胞工厂管道的转接头交辅助人员，用盖子盖紧右侧的细胞工厂接
口，将细胞工厂放平。然后将管道内残夜打入准备好的T25 cm2 培养瓶中作对照。
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒
辅助人员先用酒精棉球外焰消毒 MEM 桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸
向 外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松
动, 一次性取出管道并放入 MEM 桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近
创造无 菌环境。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内，
加完后 混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。
注意事项：操作人员取管道时连接 MEM 液桶内管道不能碰到包装纸外部，将管道放入
MEM液桶内时，伸入桶内管道不能碰到MEM液桶外部，否则此管道停止使用。
辅助人员将PBS 打开，用火焰消毒瓶口，放到盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂内
上清倒入废液桶，然后将细胞工厂平放在桌面上，倒入 PBS，加入量：1L/CF10(〜ml/cm2),
辅助人员打开消化液瓶口，用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂平
放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10~ ml/cm2)。平衡后放平，摇晃细胞工厂，
使消化液铺满整个细胞面，带细胞间质疏松后倒掉，盖好盖子放到恒温室5-10 分钟。
注意事项:室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱
当细胞开始脱落时，将细胞工厂竖立在台面上，把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞
辅助人员双手握住细胞工厂，上下小幅度快速震荡，使细胞充分分散。然后连接生长液，将
将细胞悬液分4 份均匀打入4 个10 层细胞工厂，并将残液打入培养瓶中作对照。
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒
辅助人员先用酒精棉球外焰消毒 MEM 桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸
向 外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松
动, 一次性取出管道并放入 MEM 桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近
创造无 菌环境。PBS、消化液管道均按此方法安装。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人
员用配 液直管将LONG8溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头
注意事项：操作人员取管道时连接桶内管道不能碰到包装纸外部，将管道放入桶内时，
辅助人员将细胞工厂上清倒入废液桶，交由操作人员与 PBS 管道相连，用线L PBS 溶液，盖好盖子，摇晃几次后倒掉。
辅助人员打开消化液瓶口，用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用。操作人员将细胞工厂平
放在桌面上，倒入消化液，加入量：200ml/CF10~ ml/cm2）。平衡后放平，摇晃细胞工厂，
使消化液铺满整个细胞面，带细胞间质疏松后倒掉，盖好盖子放到恒温室5-10 分钟。
注意事项:室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉消化液，避免细胞脱落。
当细胞开始脱落时，将细胞工厂竖立在台面上，把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞
辅助人员双手握住细胞工厂，上下小幅度快速震荡，使细胞充分分散。然后连接生长液，将
将细胞悬液打入 4 个 10 层细胞工厂和 3 个 40 层细胞工厂，并将残液打入培养瓶中作对
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒
辅助人员先用酒精棉球外焰消毒 MEM 桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸
向 外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松
动， 一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近
创造无 菌环境。PBS、消化液管道均按此方法安装。辅助人员将所需溶液依次打开，操作人
员用配 液直管将溶液吸入MEM桶内，加完后混匀待用。然后拔掉直管，将带细胞工厂接头
注意事项：操作人员取管道时连接桶内管道不能碰到包装纸外部，将管道放入桶内时，
辅助人员将细胞工厂上清倒入废液桶，交由操作人员与 PBS 管道相连，用线L PBS 溶液，盖好盖子，摇晃几次后倒掉。
将细胞工厂与消化液管道相连，打入消化液，平衡后放平，摇晃细胞工厂，使消化液铺
注意事项:室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱
当细胞开始脱落时，将细胞工厂竖立在台面上，把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞
盖好盖子，辅助人员先摇晃几次，将细胞冲洗下来。然后将悬液集中到顶部，双手握住细胞
工厂快速摇晃，放倒后再来一次，使细胞充分分散。然后连接生长液，将细胞悬液打入生长
将细胞悬液打入4 个10 层细胞工厂和11 个40 层细胞工厂，并将残液打入培养瓶中作 对
辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上，放置到恒