1、目前，肉类食品作为人们日常饮食中最重要的蛋白质来源，其主要由传统畜牧行业生产，随着人口数量的增加，人们生活水平的提高以及对环境友好产业的关注，开发新型的替代蛋白质越来越受到重视。细胞培养肉是一种由体外培养细胞生产肉类食品的新兴技术，相比传统畜牧业更加环境资源友好。
2、在细胞培养肉的培养过程中，支架材料作为细胞的黏附载体扮演着重要的角色，其为细胞的黏附、增殖、分化提供场所，并且提供一定的食用口感。目前用于细胞培养肉的支架大致可以分为水凝胶支架、多孔支架以及纤维支架。其中水凝胶支架最为常见，并且可以配合3d生物打印技术实现各种形状的支架制备，多孔支架多由冷冻干燥方法制备，其具有多孔的海绵状结构，但是这两种支架都不具备取向结构，无法诱导分化后的肌肉纤维定向排列。而纤维支架由细长的纤维组成，在与细胞大小相匹配的尺度下可以为细胞的生长提供地形引导，从而使肌肉纤维取向排列，更加有助于肌肉纤维的成熟，可以从外观和口感方面提高细胞培养肉产品与线、纤维支架的制备方法包括各种纺丝技术，如干法纺丝、湿法纺丝、静电纺丝等。海藻酸钠是一种来自于海洋的天然多糖，其溶液可以与二价金属阳离子发生耦合形成“蛋盒”结构，快速固化形成水凝胶。目前海藻酸钠基支架材料的制备，多是利用其可与二价金属阳离子快速耦合固化形成水凝胶的特性来加工，出于生物安全考虑，金属离子多选用钙离子，如cn114622296a公开了一种连续化制备细胞培养肉可食用纤维支架的方法。然而钙离子交联的海藻酸水凝胶如果暴露于含有钠钾阳离子的生理盐水或培养基中，其“蛋盒”结构中的钙离子易与钠钾离子发生置换，从而导致“蛋盒”结构瓦解，致使水凝胶在细胞培养的过程中快速降解，不适宜进行长时间的细胞培养。此外，由于海藻酸钠的聚合物分子链上含有大量羧基，这使海藻酸盐基的材料带有负电荷，不利于细胞在材料上的黏附。
4、综上所述，开发新型用于细胞培养肉的纤维支架，具备高稳定性及粘附性，对于细胞培养肉领域具有重要意义。
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于细胞培养肉的纤维支架及其制备方法和应用，开发新型具备高稳定性及粘附性的用于细胞培养肉的纤维支架。
3、第一方面，本发明提供一种用于细胞培养肉的纤维支架的制备方法，所述制备方法包括：
6、本发明中，采用具有醛基修饰及甲基丙烯酰胺修饰的海藻酸钠进行湿法纺丝，可以增强纤维支架的黏附性能；同时使纤维支架具有光固化特性，碳碳双键之间形成稳定的共价连接，从而延长纤维支架的降解时间，实现可以使用单一一种主原料来制备纤维支架，同时在培基中实现较长时间的结构稳定性和更高的细胞粘附性。
9、优选地，所述光引发剂包括2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯(tpo)、2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(i2959)或苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂(lap)中任意一种或至少两种的组合。
14、利用所述纺丝溶液在凝固液中进行纺丝得到初生丝，对所述初生丝进行拉伸及紫外光照射，进行后处理，得到所述用于细胞培养肉的纤维支架。
15、可以理解，本领域常用的湿法纺丝方法及设备均适用于本发明，湿法纺丝设备可以是任何能够给聚合物溶液提供一定挤出速度的设备，能够提供一定卷绕拉伸功能的设备，能够为挤出的聚合物溶液提供凝固浴场所的设备的组合。
16、本发明一具体实施例中，湿法纺丝设备为自制，其组成包括微量灌注泵、注射器、悬臂式机械搅拌器、搅拌桨、聚四氟乙烯接收管、接受浴、紫外光灯。通过微量灌注泵控制，将注射器中的纺丝溶液按一定速度从针头挤出至接受浴中迅速固化形成较粗的纤维丝，再由悬臂式机械搅拌器带动固定在搅拌桨上的接收管旋转牵引拉伸固化的纤维，拉伸过程中使用紫外光灯照射纤维丝以实现二次交联。所选用注射器内径为0.33～1.4cm，微量灌注泵设置推进速度为50～200μl/min，所选用针头规格为20～30g，搅拌器旋转速度为50～100rpm，接收辊外径为2～3cm，紫外光灯波长选用365～405nm。纺丝结束后将纤维束从接受辊上取下流水冲洗5～20min。
17、优选地，所述氯化钙溶液中钙离子浓度为0.2m～0.6m，包括但不限于0.3m、0.4m或0.5m。
22、可以理解，本发明利用经化学改造后的海藻酸钠包括醛基的修饰和甲基丙烯酰胺的修饰，结合湿法纺丝，显著改善了纤维支架的性能，本领域常用的醛基的修饰和甲基丙烯酰胺的修饰方法均适用于本发明，例如向海藻酸钠大分子链修饰醛基的方法可以是高碘酸钠氧化，也可以是经氨基修饰后再接枝二醛类化合物等向海藻酸钠大分子链修饰醛基的任何方法；甲基丙烯酰胺的修饰可以是2-氨基乙基甲基丙烯酸酯的接枝，也可以是甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酐等任何可以向海藻酸钠大分子链上修饰共轭双键基团的方法。
24、将海藻酸钠的溶液与高碘酸钠混合，进行反应，终止反应后进行后处理得到醛基修饰的海藻酸钠；将所述醛基修饰的海藻酸钠的溶液与n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐混合，再与2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐混合，进行反应，进行后处理得到具有醛基及甲基丙烯酰胺修饰的海藻酸钠。
29、优选地，所述1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐的工作浓度为2～5mg/ml。
31、本发明一具体实施例中，所述醛基修饰的海藻酸钠的溶液可以为溶解有醛基修饰的海藻酸钠的mes缓冲溶液，所述mes缓冲溶液中2-吗啉乙磺酸(mes)浓度为5～20mg/ml，氯化钠浓度为20～50mg/ml。
34、本发明一具体实施例中，使用透LONG8析袋透析，透析袋截留分子量为3500da，透析过程换水4～8次，透析温度为20～30℃，冷冻干燥时间为12～36h，温度为-80℃～-50℃。
36、(1)将海藻酸钠的溶液与高碘酸钠混合，进行反应，终止反应后进行后处理得到醛基修饰的海藻酸钠；
37、将所述醛基修饰的海藻酸钠的溶液与n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐混合，再与2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐混合，进行反应，进行后处理得到具有醛基及甲基丙烯酰胺修饰的海藻酸钠；
39、(3)利用所述纺丝溶液在凝固液中进行纺丝得到初生丝，对所述初生丝进行拉伸及紫外光照射，进行后处理，得到所述用于细胞培养肉的LONG8纤维支架。
40、第二方面，本发明提供一种用于细胞培养肉的纤维支架，所述用于细胞培养肉的纤维支架由第一方面所述的制备方法制备得到。
41、第三方面，本发明提供第二方面所述的用于细胞培养肉的纤维支架在制备细胞培养肉中的应用。
42、第三方面，本发明提供一种制备细胞培养肉的方法，所述方法包括利用第二方面所述的用于细胞培养肉的纤维支架培养细胞，得到所述细胞培养肉。
43、优选地，所述细胞为动物细胞，进一步优选地，所述细胞为哺乳动物细胞。
45、本发明采用具有醛基修饰及甲基丙烯酰胺修饰的海藻酸钠进行湿法纺丝，可以增强纤维支架的黏附性能；同时使纤维支架具有光固化特性，碳碳双键之间形成稳定的共价连接，从而延长纤维支架的降解时间，实现可以使用单一一种主原料来制备纤维支架，同时在培基中实现较长时间的结构稳定性和更高的细胞粘附性，提高培养细胞的数量和伸展情况。
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