本发明涉及一种用于在无血清培养基或低血清培养基中培养/增殖细胞的方法，以及用于所述方法的培养基添加剂和培养基组合物。本发明涉及一种用于在无血清或低血清培养基中产生其中扩增了期望的细胞的数量的细胞群的方法，以及含有通过所述方法获得的细胞群的药物。
1、按常规，细胞培养是使用含有血清的培养基(以下也称为“含血清培养基”)来进行的。例如，胎牛血清(fbs)作为细胞增殖的重要添加剂，广泛用于细胞培养。然而，当培养细胞或其衍生物用于医疗目的时，异种组分可能成为血源性病原体或异源抗原的感染源。另外，血清批次之间的差异可能造成培养结果的变化。出于此原因，近年来，尽可能减少要使用的血清量以及使用具有明确化学组成的培养基(化学成分确定的培养基)培养细胞已成为主流，并且无血清培养基和低血清培养基的开发正在进行中。
2、近来，嵌合抗原受体(car)t细胞(以下简称为car-t细胞)疗法已被开发为癌症患者的免疫疗法之一，其中对细胞毒性t细胞(ctl)的t细胞受体(tcr)进行遗传修饰以使ctl直接并选择性地识别肿瘤细胞，并且发挥了抗肿瘤作用。使用car-t细胞的癌症疗法基于不同于常规抗癌药物和放射疗法的机制杀伤癌细胞，并因此期望对顽固性或难治性癌症有效。目前的car-t细胞疗法一般使用自体car-t细胞疗法进行，其中将car基因离体引入到从患者收集的t细胞中，并且然后将由此产生的car-t细胞施用至患者，如在美国获批的kymriah(商品名称)和yescarta(商品名称)。然而，此方法需要经过长时间段的多个步骤，诸如t细胞的活化/增殖、病毒载体的制备以及向t细胞中的基因转移，并且因此由于细胞培养和病毒载体的制备所需的成本而存在制造成本高的问题。因此，已经开发出能够实现同种异体car-t疗法的ips细胞来源的car-t细胞。在此方法中，在产生ips细胞来源的car-t细胞的过程中，特别是在扩增培养过程中，也使用含血清的培养基，以达到充分的细胞增殖效果。然而，从gmp(良好生产规范)的观点来看，培养基优选为xeno-free的，即不含有异种组分，且最好是无血清或低血清的。另外，考虑到与原代t细胞相比，源自ips细胞的t细胞特别容易受到洗涤压力的影响，因此对不需要大量洗涤的无血清或低血清培养基的需求强烈。
3、关于在细胞培养中维持期望的细胞增殖效果或促进细胞增殖效果的方法已有很多报道。例如，也有关于硼酸经由其转运蛋白nabc1发挥细胞增殖作用的报道(非专利文献1)。然而，这里使用的培养基是含血清培养基，并且在无血清培养基或低血清培养基中是否能达到同样的细胞增殖效果尚不清楚。专利文献1中描述了一种含有硼酸盐并且适合用于培养二倍体细胞的无血清培养基。另外，非专利文献2中描述了，牛磺酸转运蛋白taut对t细胞的回忆反应很重要。
2、本发明旨在提供一种用于在无血清培养基或低血清培养基中培养并且充分增殖细胞、特别是免疫活性细胞的方法，以及待用于所述方法的培养基添加剂和培养基组合物。此外，本发明旨在提供一种用于在无血清培养基或低血清培养基中产生具有扩增的期望的细胞、特别是免疫活性细胞的数量的细胞群的方法，以及含有通过所述方法获得的细胞群的药物。
4、鉴于上述问题，本发明人制备了待添加到无血清或低血清培养基中的各种因子，并研究了它们对细胞培养或增殖的影响。作为结果，通过添加硼酸或其盐，即使当使用无血清培养基或低血清培养基时，也证实了与在含血清培养基中培养所达到的可比的维持和促进细胞增殖的效果。基于这些发现，他们找到了更优选的培养条LONG8件并且完成了本发明。
6、[1]一种用于培养细胞的方法，其包括在包含硼酸或其盐的无血清培养基或低血清培养基中培养所述细胞的步骤。
7、[2]如上述[1]所述的方法，其中所述培养基中所述硼酸或其盐的最终浓度为0.1mm至0.9mm。
8、[3]如上述[1]所述的方法，其中所述培养基中所述硼酸或其盐的最终浓度为0.3mm至0.6mm。
9、[4]如上述[1]至[3]中任一项所述的方法，其中前述无血清培养基或低血清培养基是无血清培养基。
10、[5]如上述[1]至[4]中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫活LONG8性细胞。
11、[6]如上述[5]所述的方法，其中所述免疫活性细胞选自树突状细胞、b细胞、t细胞和自然杀伤细胞。
13、[8]如上述[1]至[7]中任一项所述的方法，其中所述细胞源自多能干细胞。
15、[10]如上述[1]至[9]中任一项所述的方法，其中前述培养基进一步包含牛磺酸。
16、[11]一种用于增殖细胞的方法，其包括在包含硼酸或其盐的无血清培养基或低血清培养基中培养所述细胞的步骤。
17、[12]如上述[11]所述的方法，其中前述无血清培养基或低血清培养基是无血清培养基。
18、[13]如上述[11]或[12]所述的方法，其中前述培养基进一步包含牛磺酸。
19、[14]一种用于产生其中扩增了期望的细胞的数量的细胞群的方法，其包括在包含硼酸或其盐的无血清培养基或低血清培养基中培养包含所述期望的细胞的细胞群的步骤。
20、[15]如上述[14]所述的方法，其中前述无血清培养基或低血清培养基是无血清培养基。
21、[16]如上述[14]或[15]所述的方法，其中前述培养基进一步包含牛磺酸。
22、[17]一种药物，其包含通过如上述[14]至[16]中任一项所述的方法获得的细胞群。
24、[19]一种培养基添加剂，其包含硼酸或其盐，其中所述培养基是无血清培养基或低血清培养基。
25、[20]如上述[19]所述的添加剂，其中前述无血清培养基或低血清培养基是无血清培养基。
26、[21]如上述[19]或[20]所述的添加剂，其中前述培养基进一步包含牛磺酸。
27、[22]一种培养基组合物，其包含硼酸或其盐，其中所述组合物是通过将如上述[19]至[21]中任一项所述的培养基添加剂添加到无血清培养基或低血清培养基中获得的。
28、[23]如上述[22]所述的培养基组合物，其中前述无血清培养基或低血清培养基是无血清培养基。
30、[25]一种用于预防和/或治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用通过如上述[14]至[16]中任一项所述的方法获得的细胞群。
31、[26]一种细胞群，其通过如上述[14]至[16]中任一项所述的方法获得，所述细胞群用于预防和/或治疗癌症。
32、[27]通过如上述[14]至[16]中任一项所述的方法获得的细胞群在生产用于预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
34、根据本发明，即使当使用无血清培养基或低血清培养基时，也可获得与在含血清培养基中培养可比的维持-促进细胞增殖的效果。具体而言，对于受到因诸如细胞洗涤等操作而造成的压力的影响的细胞，优选在不需要大量洗涤的无血清培养基或低血清培养基中进行培养，并且细胞适合在此类条件下进行培养。