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第一节单细胞培养第二节细胞悬浮培养第三节植物细胞生长和活力的测定第四节植物细胞培养的应用
植物细胞培养，即对植物器官或愈伤组织上分离的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。第一节单细胞培养一、定义单细胞培养：对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再经过分化形成芽、根等器官或胚状体，甚至长成完整植株的技术。二、意义1、建立单细胞无性系2、对培养的单细胞可以诱发突变3、排除体细胞干扰4、遗传转化受体的建立（二）微室培养法
人工制造一个小室（载玻片和盖玻片），将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气，便于观察。注意载玻片厚度1mm，微室厚度最好不超过20um，盖玻片厚度在0.17-0.18mm左右，观察效果才好。（三）平板培养法
平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。步骤：1、单细胞悬浮液的制备2、悬浮细胞密度的调制3、琼脂培养基的配制4、平板制作5、培养（四）条件培养基：在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。方法：把液体培养基中培养了4-6周的高密度细胞过滤掉，将其培养基制成液体培养基或固体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体，这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能力。第二节细胞悬浮培养细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。建立在愈伤组织的液体培养技术基础上。目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培养。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。1、愈伤组织诱导材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将材料切成小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基上——得愈伤组织——扩大繁殖。2、单细胞悬浮液的制备愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转床培养10d——140m×140m的细胞筛过筛——使细胞密度达到10个/ml左右——得单细胞悬浮液。
在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：
（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。二、培养类型和方法（一）成批培养
指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。
（3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。
（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进LONG8股份有限公司行培养。1、成批培养法细胞生长周期延滞期对数增长期直线生长期缓慢期静止期时间
细胞数目（二）半连续培养指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。
在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。
（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间延长，细胞密度不断增加。开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性，采取的控制方法：
三、悬浮细胞的继代在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为2周的可用1：10的接种量。在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期末就进行继代。四、培养细胞的同步化同步培养：在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段，同步性的程度以百分百分数表示。实现悬浮培养细胞同步化的方法：1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入分裂。2、抑制法：使用DNA合成抑制剂，也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞都滞留在G1期和S期的边界，当把这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。为了改善液体培养基中材料的通气状况，需进行培养基的不断振荡：
需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。六、影响细胞培养的因素2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能够增加细胞的分散度。4、pH和二氧化碳浓度在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定PH的一种方法。二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。第三节植物细胞生长和活力的测定一、悬浮培养中细胞生长的测定1、细胞计数：把1份培养物加入到2份8%三氯化铬溶液中，在70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用血球计数板进行细胞计数。2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。3、细胞鲜重和干重：4、细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数二、培养细胞活力的测定1、TTC法2、荧光素二乙酸法（FDA法）3、伊凡蓝染色法第四节植物细胞培养的应用一、植物次生代谢产物的生产二、突变体选择三、诱导多倍体
通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、抗血平、橡胶、类固醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质.
三七皂苷（含量达干重的10.25%）●三分三的愈伤组织中——茛菪碱（含量可达干重的0.55%
天然色素，绛红色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妆品生产紫草紫草根紫草素醌类芦丁、槲皮素：治疗心脑血管疾病药物的主要成分。
槲皮素R=H芦丁R=芸香糖银杏黄酮、大豆黄酮等也是防治心血管疾病的重要物质。黄酮类（二）生产转化定义：利用生物系统通过水解、加氢、羟基化作用、氧化还原及脂化反应，将有机分子转化为新的化合物的过程。方法：（1）给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物。目的：得到自然界中不存在的化合物。（2）给细胞提供植物天然产物中间体。目的：提高该种天然化合物在细胞中的产量。
（三）细胞的工厂化生产步骤：（1）高产细胞株的选择（2）“种子”培养（3）细胞的规模培养二、突变体选择
突变体育种缺点：对多细胞有机体进行诱变处理后会形成嵌合体利用细胞培养进行突变体选择，多采用离体的单倍体细胞，因为它能加强获得隐性突变体的机会。还可以在很小的空间操作千百万潜在的植株。
方法：在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的物质，当多LONG8股份有限公司数细胞死去以后，把少数能存活的细胞系分离出来，转入含有同种毒素但浓度更高的培养基上，进一步检验这些细胞系的突变性质。（2）间接选择法（负选法）适用于目标表现型不具有选择上的优势，即细胞未产生某种抗性物质，而是产生了一种代谢形式或表现形式的性状。如：在抗氯酸盐细胞的选择中，分离出了硝酸还原美确实突变的细胞系。硝酸还原酶可还原硝酸成亚硝酸，加入氯酸盐，硝酸还原酶也可还原氯酸盐成亚氯酸盐。亚氯酸盐的毒性比氯酸盐高几百倍。如果细胞含有硝酸还原酶，在培养基中加入20-80mmol/L氯酸盐，此浓度氯酸盐虽不足以杀活细胞，但氯酸盐可被还原成亚氯酸盐，使这些细胞被杀死，存活下来的只有硝酸还原酶确实的突变细胞。为了克服远缘杂种的不育性，常需要进行染色体数目的加倍。若能通过染色体加倍而恢复其育性，就能使杂种在育种工作中得到充分利用。采用细胞培养方法可以达到这个目的。利用培养过程中染色体的自发加倍现象，也可使单倍体细胞加倍，获得纯合二倍体植株，在遗传育种上有重要意义。三、诱导多倍体
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