实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心
管，培养瓶（25cm），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，
实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也
将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验
拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细
胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸
拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶加入培养瓶中，混
从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL
配平后离心200×g，3min。将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面
离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。加入新DMEM培养液（按
2mL／瓶和细胞传代数计算加入的培养液体积），用电枪反复吹打使细胞充分混匀，要尽量
混匀后将细胞分装，按2mL/瓶得体积加入培养瓶中，充分混匀。记号笔标记细胞名称，培
将细胞放于37℃,4%CO2细胞培养箱培养。将0.25%胰酶，细胞培养液密封好放于4℃冰箱
1．紫外消毒过程中会产生臭氧分子，对人体有害。一般情况下，消毒后至少半小时后再进
2．所有的实验器材都要经过消毒处理；所有的细胞操作都在安全柜中进行，每一步都要注
意不能用手碰到瓶口，培养液不能碰到瓶口，拿培养瓶时要使培养瓶的瓶口微微翘起。
3．细胞消化时间不能太长，要让细胞尽快脱离不舒服的环境；离心时离心机转速不能太高，
实验前要设定好离心转速和时间；重悬细胞时要保证细胞完全混匀，在显微镜下观察细胞是
4．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火
焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
5．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅
实验材料：水浴锅，安全柜，冻存细胞，细胞冻存管，培养瓶，移液枪，移液管（5ml，10ml），
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速
融化。同时配培养液：向50mL离心管内加入9mlDMEM细胞培养液+1mL血清+100uL抗
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台
2．将剩余的6mL细胞培养液加入到离心后的细胞中，使细胞重悬，充分混匀。
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，培养瓶标明细胞名称，培养液，实验人员，
实验时间；将培养瓶放入37℃和4％CO2的培养箱内培养。24-48h后换液继续培养培养，
4.依据冻存细胞相应的培养基种类、血清种类和其它指定的成份和比例，制备培养基。绝大
多数的细胞均无法立即适应不同的龙8基础培养基或不同的血清种类，若因实验需要，必须有
所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，进行所需之实验。
6.取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，
实验原理：细胞冻存的基本原则是缓慢冷冻，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，
实验材料：安全柜，离心机，恒温水浴锅，冰箱（4℃、-20℃），显微镜，培养箱，液氮罐，
吸管，培养瓶，枪头，移液管，50ml离心管，冻存管（1～2ml）微量加样枪，
记号笔，移液枪，培养液，胰蛋白酶（0.25%），DMSO（分析纯）冻存盒（异丙
拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细
胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL0.25%胰酶，混匀，放于37℃
从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL
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