精品文档细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外(30min)和房间大紫外(30min)。显微镜开启使用后将光调暗,最后一个操作者将显微镜关闭。超净台用完收拾干净,移液器、盒子等摆放整齐。带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。细胞培养盘至少需备注:所属者,细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注:所属者,物品名称。基培需写上开启时间。细胞培养标准流程1、细胞换液、传代(以圆盘培养为例)Note:所有用于培龙8娱乐平台养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品(包括双手)进入安全柜之前要酒精消毒。步骤::高倍镜下观察细胞状态、:细胞生长融合达90%时,:PBS(2mL)漂洗1-:%胰蛋白酶,轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶,后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,,轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2脱壁。:吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。:轻轻吹打混匀,(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形),吹打成单细胞悬液后按1:2或1:3比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。(大盘10ml全培,小盘6ml全培)(细胞生长快留30%,慢40%-50%;其余细胞可提取蛋白或RNA):每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。.精品文档龙8娱乐平台2、细胞转染TurboFect转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后)细胞接板24h后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。以6孔板为例,转染前细胞先换液,加4ml全培。,加入400μL无血清无双抗DMEM培养液,加入质粒2μg,混匀后静置5min,再转染试剂4μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍),室温静置15-20min。(转染试剂需加在培养液中部,切忌勿贴壁;静置时间不可超过20min)无血清无双抗DMEM量=全培体积的10%。如6孔板加4mL培养液培养,即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。缓慢均匀加到培养液后,轻轻晃动圆盘,使其均匀分布。转染后6h后细胞换液,排除试剂的毒性影响。24~48h后收集细胞用于后续实验。Note:如果用这种方法转染效率一直不佳,可以在接种细胞前,把转染试剂配好,把转染试剂加到培养盘上,再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞,这种方法会导致细胞死亡,不贴壁。HiPerFect转染试剂转染(用于siRNA的转染,说明书附后)ellswithsiRNAandmiRNA5610细胞于孔板每孔。转染之前,6孔板为例,-6以染90%)将细胞放置在培养箱中培养,直至转染。(前50%---DMEM培养液,,加入100μL无血清无双抗,轻轻混匀,室温浓度,)5uL,转染试剂12μLsiRNA(20uM静置5-10min。。(比例待定)12ul:转染试剂:无血清无双抗DMEM5uL::100ulsiRNA将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后,轻轻晃动圆盘,使其均匀分布。后收集细胞用于后续实验。~(慢冻快融)、细胞冻存31)配冻存液:全培+10