细胞传代培养操作流程 细胞复苏： 1. 将新鲜培养基置于 37℃水浴锅中回温， 回温后喷以 75%酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。 如配置： 50mL 完全培养基(含 10%FBS， 1%青链霉素双抗) 44.5mL 基础培养基 + 5mL FBS + 0.5mL 青链霉素双抗。 2. 戴防护手套后， 自液氮罐中取出冷冻管， 检查盖子是否旋紧， 立即放入 37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡） ， 轻摇冷冻管使其在 2分钟内全部融化， 以 75%酒精擦拭保存管外部， 移入无菌操作台内。 3. 将解冻的 1mL 细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内， 再向瓶中加入 10mL 完全培养基(稀释比例为 1:10)， 混合均匀， 放入 ...
细胞传代培养操作流程 细胞复苏： 1. 将新鲜培养基置于 37℃水浴锅中回温， 回温后喷以 75%酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。 如配置： 50mL 完全培养基(含 10%FBS， 1%青链霉素双抗) 44.5mL 基础培养基 + 5mL FBS + 0.5mL 青链霉素双抗。 2. 戴防护手套后， 自液氮罐中取出冷冻管， 检查盖子是否旋紧， 立即放入 37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡） ， 轻摇冷冻管使其在 2分钟内全部融化， 以 75%酒精擦拭保存管外部， 移入无菌操作台内。 3. 将解冻的 1mL 细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内， 再向瓶中加入 10mL 完全培养基(稀释比例为 1:10)， 混合均匀， 放入 37℃， 5%CO2的恒温培养箱中培养。取 0.1ml 解冻细胞悬液作存活测试。 (Sf9 细胞在 27℃生长， 可不需 CO2) 4. 一般而言， 细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如 DMSO)。 若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有 5-10ml 培养基之离心管内， 离心 LONG8股份有限公司1300rpm， 5分钟， 移去上清液， 加入新鲜培养基， 混合均匀， 放入 CO2培养箱培养。 若不需立即去除冷冻保存剂， 则在解冻培养后隔日更换培养基。 传代培养： 1. 37℃恒温培养约 48 小时， 待细胞长满 80-90%后， 从培养箱取出 75cm2培养瓶， 倒掉培养基。 加入 5mLPBS 缓冲液吹打以洗去残留血清， 倒掉缓冲液。 2. 沿壁（无细胞的一面） 缓缓加入 1mL 胰酶溶液消化细胞约 1min， 轻轻摇晃，倒掉残余胰酶， 将培养瓶置于恒温箱中约 1min， 拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。 注意： 最佳消化温度是 37℃， 加液后用移液管反复吹打分散细胞。 3. 向瓶中加入 5mL 完全培养基， 反复吹打均匀 2min， 从中取出 20l 至 0.5ml小离心管中， 向管中加入 80l 台盼蓝溶液， 混匀， 从混合液中取出 10l 至盖好盖玻片的计数板上， 计算细胞密度及活率。 4. 将 5mL 细胞悬液全部吸出， 分别接种 1mL 悬液到原培养瓶和另一新的培养瓶中， 其余舍弃。 再向两瓶中各加入 10mL 完全培养基， 置于 CO2培养箱培养。 （细胞传代时按 1： 5 或更大比例稀释）